在玉米育种特别是杂交种的选育过程中，杂交种亲本的遗传特性非常重要，它是杂交种的鉴定和注册的基础。育种家们准确的掌握亲本自交系的遗传特性，结合已有的分子标记指纹图谱，有利于杂交育种。获取杂交种和其亲本的分子指纹图谱的一般技术是首先知道杂交种的亲本，然后通过实验建立分子指纹图谱（李新海等，2003）（吴渝生等，2003）。但是在新品种的指纹收集和在玉米品种纯度鉴定中，出于商业考虑，杂交种拥有者提供假亲本或者是不提供亲本资料信息，这给我们实验人员带来了很多的困难，然而我们从杂交种F1代种子可以得到亲本自交系遗传特性（Wang J等，2002）。种皮组织的遗传物质来自于母本（Poething R S等，1982），F1代杂交种的种胚及其种皮的DNA通过SSR（Simple sequence repeats）分子标记可以得出杂交种母本的指纹图谱，结合杂交种DNA的SSR标记结果就可以获得杂交组合父母本的全部DNA指纹图谱了。本实验用13个自交系及其通过正反交组配的20个杂交组合，分别分离并提取种皮DNA及种胚DNA，每个组合选取其特异的10对SSR分子标记进行标记分析，从分子水平上探讨F1代种子中所蕴含的分子信息，揭示玉米杂交种种皮遗传信息量与母本遗传信息量的关系，研究结果将为实施玉米种子质量监控和知识产权保护提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
选用玉米育种中常用自交系13份，2005年冬在海南组配杂交种（表1）
表1 实验材料
编号 正交组合 反交组合
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 沈137×K12
掖478×丹340
吉853×Mo17
P138×综31
444×Mo17
吉846×丹340
黄早4×Mo17
郑58×昌7-2
E28×沈5003
齐319×鲁9801 K12×沈137
丹340×掖478
Mo17×吉853
综31×P138
Mo17×444
丹340×吉846
Mo17×黄早4
昌7-2×郑58
沈5003×E28
鲁9801×齐319

1.2 研究方法
1.2.1 DNA提取
亲本自交系以及杂交种DNA提取：种小苗，每个样品混合取10个单株叶片，用改进的CTAB法提取DNA（颜廷进等，2003）。
杂交种种皮DNA提取：将20粒种子放入2.5%的NaOH溶液中1分钟，取出蒸馏水冲洗3-5分钟，用镊子小心剥下种皮放入蒸馏水中清洗一次，晾干，液氮研磨，收集种皮粉末放入2.0ml的离心管中，加入700µl的65℃水浴预热的CTAB提取液（100mM Tris-7.5，700mMNaCL，50mM EDTA （8.0），1% CTAB）和20µl的β-巯基乙醇，振荡混匀，再加入700ml氯仿异戊醇（24：1），均与振荡10min，8000r/min离心10min，将上清液转移到1.5ml的离心管中，加入800µl冰冻无水乙醇静置沉淀DNA，10000r/min离心5分钟，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇，10000r/min离心1min，倒掉上清液，再加1ml70%乙醇清洗，去上清液，晾干，加入80µl双蒸水溶解DNA。
1.2.2 SSR引物选择
按照本实验室的实验数据和发表的文章（肖木辑等，2006）（李新海等，2003），依据条带清晰，父母本多态性高，且在染色体上均匀分布等特点，每个正反交组合选出10对SSR引物（表2）。
1.2.3 PCR扩增反应按照以下反应条件进行PCR扩增：在10µl反应体系中，包括10 mmol/LTris- HCl，50 mmol/L KCl，0.001% Gelatin，1.5 mmol/L，MgCl2，4种dNTP 各0.25mmol/L，0.3mmol/L SSR 引物，2UTaq 酶，25ngDNA模板。PCR反应程序为：94℃模板DNA预变性5min，1个循环；94℃模板DNA变性45s，60℃退火45s，72℃引物沿模板延伸1min，共35个循环；zui后在72℃延伸5min，降至4℃取出后变性。
电泳、银染：，用4.5% 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，使用Bio-RAD公司的电泳设备，38cm×30cm×0.4mm测序胶板，恒定功率60W，电泳45min；胶板放入10%酒精和0.5%醋酸溶液7min，蒸馏水2min，0.1%AgNO3溶液10min，蒸馏水2s，1.5%NaOH溶液，直至带型清晰，蒸馏水漂洗3min。
表2 10对正反交组合特异性引物
编号 引物
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 phi109275、phi029、phi034、phi076、phi123、phi423796、phi114、phi014、phi065、umc1196
phi011、phi127、phi029、phi072、phi024、phi078、phi116、phi015、phi108411、umc1196
phi064、phi083、umc1555、phi072、phi024、phi123、phi057、phi015、phi444880、umc1196
phi056、phi083、phi047、phi076、phi024、phi123、phi112、phi080、umc1277、umc1061
phi056、phi127、phi029、phi102228、phi024、phi112、phi057、phi015、umc1277、umc1061
phi109275、phi127、phi046、phi047、phi034、phi024、phi014、phi065、phi050、phi047
phi064、phi127、phi029、phi374118、phi109188、phi123、phi116、umc1161、phi108411、umc1196
phi011、umc1555、phi046、phi072、phi024、phi123、umc1545、phi015、phi065、umc1196
phi011、umc1124、phi046、phi034、phi076、phi024、phi116、phi015、phi065、phi063
phi109275、phi374118、phi072、phi085、phi089、phi057、phi112、phi080、phi233376、umc1061

2. 结果与分析
2.1 种皮提取DNA

根据热胀冷缩的原理，先将种子放在清水里浸泡12小时，然后将种子放在通风的地方半小时，种子干了之后用刀片将脐切掉，以防胚组织将种皮污染。用镊子将种皮剥下，然后用洁净的*柄和吸水纸将种皮上面的一些杂质去掉，这种方法剥离种皮速度相对较慢一些。另外一种方法是用2.5%的NaOH溶液进行浸泡1min，然后用双蒸水冲洗，可以明显的看到种皮皱褶，基本上和其他组织分离，皱褶的种皮上肉眼看上去比较干净，，只要用镊子就很容易剥离下来，剥离种皮的速度相对较快。
表3 实验记录
　 正交母本 正交种皮 反交母本 反交种皮 杂交种胚 　 正交母本 正交种皮 反交母本 反交种皮 杂交种胚组合1 沈137×K12 组合6 吉853×丹340
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B AB AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
组合2 掖478×丹340 组合7 黄早4×Mo17
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B AB AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B AB AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
组合3 吉853×Mo17 组合8 郑58×昌7-2
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B AB AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
组合4 P138×综31 组合9 E28×沈5003
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A A B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB
组合5 444×Mo17 组合10 齐319×鲁9801
1 A A B B AB 1 A A B B AB
2 A A B B AB 2 A A B B AB
3 A AB B B AB 3 A A B B AB
4 A A B B AB 4 A A B B AB
5 A A B B AB 5 A A B B AB
6 A A B B AB 6 A A B B AB
7 A A B B AB 7 A A B B AB
8 A A B B AB 8 A A B B AB
9 A A B B AB 9 A A B B AB
10 A A B B AB 10 A A B B AB

2.2 DNA分子标记结果分析
杂交种DNA扩增产物SSR标记的胶板照片如图1所示，其中1、2、3、4、5分别是正交组合母本、正交杂交种种皮、反交组合母本、反交种种皮和杂交种胚五种来源的DNA分子标记图。从图片中可以看出正交组合母本和正交杂交种种皮DNA扩增带型的指纹一致，反交组合母本和反交种种皮DNA扩增带型的指纹一致，杂交种胚DNA扩增带型为正、反交母本的杂合带型，也就验证了杂交F1代种胚DNA来自父母本，种皮DNA来自母本。

注：每个引物标记中1、2、3、4、5分别是正交组合母本、正交杂交种种皮、反交组合母本、反交种种皮和杂交种胚五种来源的DNA分子扩增带型
图1 黄早4×Mo17正反交组合分子标记图
统计10个正反交杂交组合和每个组合的10对引物的分子标记结果见表3. 结果表明：97.5%的种皮DNASSR标记表现为纯合带型，与母本相同，2.5%的表现为杂合性条带，与杂交种相同。如：组合沈137×K12，引物phi114标记结果为反交杂交种种皮DNA扩增带型与杂交种相同，其余的种皮DNA扩增带型与母本相同；组合掖478×丹340，phi072，phi108411标记的结果也都是反交杂交种种皮DNA扩增带型与杂交种相同，其余的种皮DNA扩增带型与母本相同。组合444×Mo17，phi029标记结果是正交杂交种种皮DNA扩增带型与杂交种相同，其余的种皮DNA扩增带型与母本相同。组合郑58×昌7-2，phi015标记结果是反交杂交种种皮DNA扩增带型与杂交种相同，其余的种皮DNA扩增带型与母本相同.其他六个正反交组合中的种皮DNA扩增带型都与母本相同。
对于这几个种皮表现为杂合带型的种子，为了排除实验人为误差（DNA在提取时和提取后被污染等人为操作原因），又进行了三次重复DNA提取实验，将三次实验提取的DNA用组合中相同的引物进行标记，标记结果仍然为杂合带型。
3. 讨论
以种皮组织作为一种鉴定工具在以前就应？开始了，开始是以种皮的颜色、厚度、种皮的表面形态和种皮细胞的大小作为一种鉴定标准（Pfahler P L等,1975），这只是从形态学上进行描述，受环境条件及其他因素影响比较大。随着分子标记的出现及其发展，利用RAPD（Randomly Amplified Polymorphic

DNA）分析玉米种皮和母本的遗传关系，结果发现两者之间有一些差异，分析认为造成差异的原因是由于RAPD的实验过程中使得种皮的DNA发生了一定的改变（Stojsin D等，1996）。SSR分子标记以多态性高，重复性好，多位点，实验简单等特点更加优于RAPD技术用于研究种皮和母本之间的遗传关系（Wang J等，2002）。
此种鉴定方法比较关键的地方就是玉米种皮的顺利剥离及其高纯度的保证（赵久然等，2004）。几种剥离方法中，都得注意要将玉米种子的脐先除掉，然后在将种皮剥离，防止种皮在剥离的时候通过种脐被种胚污染。本实验技术应用于实际操作的过程中引物的使用非常关键，选择的引物必须能使杂交种的父母本表现出多态性。而实际中我们可能没有直接来自父母本的DNA，所以很难筛选多态性引物，在没有其亲本的情况下，我们利用杂交种种皮DNA作为母本DNA，结合杂交种种胚的DNA，用SSR引物进行标记，杂交种DNA表现为杂合，种皮DNA的带与杂合带型的一条相同，此引物就可以作为获得杂交种父母本指纹图的候选引物了。同时我们可以利用李晓辉等（2005）公布的50对多态性高，扩增条带清晰，分辨率高，扩增稳定的候选引物和10对核心引物进行多态性引物筛选，获得多态性引物。
10个杂交组合获得了20个杂交种，每个组合用10对引物建立成20×10的SSR分子标记结构，所有种皮与母本的比较次数总共是200次，但是有5次的结果和其他的不同，种皮表现出与杂交种遗传信息一致。出现这种情况可能有几个方面的原因：在进行杂交种组配的时候母本在某个位点还处于杂合状态；或者在玉米受精卵发育的过程中，受精卵细胞分化出的极少数的一部分细胞与体细胞结合在一起发育成玉米种皮，导致玉米种皮DNA与种胚相同，表现出杂合状态；或是杂交组合母本在特定标记位点发生了突变，但是这种情况的出现不能否认种皮DNA来自母本。因此通过杂交种和种皮就能得到母本和杂交种的DNA指纹图谱，结合正反交组合就能够获得杂交种及其亲本的全部DNA指纹图谱了。
DNA指纹图谱数据库是玉米杂交种分子鉴定的基础，随着新杂交种的不断出现，可能会使已构建的数据库产生局限性，这就需要不断扩充数据库的规模和在更大量数据的基础上重新计算等位基因频率，从而使数据库更具代表性和性（李晓辉等，2005），但是在新品种的指纹收集和在玉米品种纯度鉴定中，需要进检方在提供杂交种子的同时提供一定的母本种子，以母本种子为参照，鉴别样品中的自交苗数。出于品种保护及商品秘密，送检方不愿或无法提供亲本种子，那么给检测工作带来很大的难度（赵久然等，2004）。本研究的实验技术可以解决这个问题，杂交种或者正反交杂交种种皮及种胚DNA为杂交种及其亲本提供*的DNA指纹图谱，完善和扩充玉米DNA指纹图谱数据库，同时也为不断壮大的玉米杂交种建立新的DNA指纹文库提供更便捷的方法。
参考文献
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10. 李晓辉,李新海,高文伟,田清震,李明顺,马凤鸣,张世煌.玉米杂交种DNA指纹图谱及其在亲子鉴定中的应用